Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Если в жидких средах обнаруживается бактериальное или грибковое загрязнение, испытание повторяют. Если не ранее, чем через семь дней после инокуляции, не более, чем одна чашка с каждой стадии испытания имеет случайные бактериальные или грибковые примеси или разбита, результаты, связанные с этой чашкой могут не учитываться, если при немедленной проверке на ней не обнаруживается признаков роста микоплазм. Если на любой стадии испытания более одной чашки подвергаются случайному загрязнению бактериями или грибами, или разбивается, испытание считают недействительным и повторяют.
Испытание проводят также для положительных контролей, приготовленных путем инокуляции не более 100 колониеобразующих единиц подходящего штамма, например, M. orale или M. pneumoniae.
В конце периодов инкубации все инокулированные твердые среды изучают под микроскопом для установления наличия микоплазм. Продукт выдерживает испытание, если ни на одной инокулированной среде не обнаружено роста микоплазм. При обнаружении роста микоплазм испытание может быть проведено повторно с использованием удвоенного количества инокулята, сред и чашек; если роста микоплазм не обнаруживается, то продукт выдерживает испытание. Результаты испытания недостоверны, если в положительных контролях не наблюдается роста соответствующих тест-организмов.
МЕТОД ИНДИКАТОРНОЙ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ
Клеточные культуры окрашиваются флуоресцентным красителем, обладающим способностью связываться с ДНК. Микоплазмы детектируются по их характерной точечной или волокнистой флуоресценции на клеточной поверхности и, при высоком уровне загрязнения, в прилегающем пространстве.
ПРОВЕРКА СУБСТРАТА
Метод подвергают предварительному испытанию с использованием субстрата клеточной культуры Веро и инокулята, содержащего не более 100 колониеобразующих единиц хорошо растущего на жидкой или твердой среде штамма, и показывают возможность определения этим методом потенциальных примесей микоплазм, например, подходящих штаммов Mycoplasma hyorhinis и Mycoplasma orale. Могут использоваться и другие клеточные субстраты, например, производственная линия клеток, если было показано, что чувствительность определения микоплазм не будет меньшей.
Метод испытания
Отбирают не менее 1 мл испытуемого продукта и используют его для засева в двух повторностях индикаторной клеточной культуры, представляющей в совокупности не менее 25 см2 площади клеточной культуры. Руководствуются указаниями подраздела «Процедура».
В испытание включают отрицательный (неинфицированный) контроль и два положительных контроля, содержащих микоплазмы, например, M. hyorhinis и M.
orale. В положительных контролях используют инокулят, содержащий не более 100 колониеобразующих единиц.
Если для вирусных суспензий на интерпретацию результатов влияют заметные цитопатические эффекты, вирус может быть нейтрализован с использованием специфической антисыворотки, не обладающей ингибирующим эффектом в отношении микоплазм или может использоваться субстрат клеточной культуры, не поддерживающий рост вируса. Для демонстрации отсутствия ингибирующего эффекта сыворотки выполняют положительные контрольные тесты в ее присутствии и отсутствии.
Процедура
1. Среду однородно засевают культурой (от 2x104 до 2x105 клеток в миллилитре, от 4x103 до 2,5x104 клеток на см2) и инкубируют при температуре 36±10С не менее 2 дней. Вносят испытуемый продукт и инкубируют не менее 2 дней; выполняют не менее одного пересева. Последнюю субкультуру выращивают на покровных стеклах в подходящих контейнерах или на другой подходящей поверхности. Не допускают достижения слияния в последней субкультуре, так как это может привести к ингибированию окрашивания и ухудшить визуализацию микоплазм.
2. Среду извлекают и выбрасывают.
3. Монослой промывают раствором хлорида натрия в фосфатном буфере рН 7,4 R, затем смесью равных объемов этого раствора и подходящего фиксирующего раствора и, наконец, чистым фиксирующим раствором; если для окрашивания используется бисбензимид R, то подходящим фиксирующим раствором является свежеприготовленная смесь 1 объема ледяной уксусной кислоты R и 3 объемов метанола R.
4. Добавляют фиксирующий раствор и оставляют на 10 минут.
5. Фиксирующий раствор удаляют и выбрасывают.
6. Если монослой будет подвергаться окрашиванию позже, его полностью высушивают. (Требуется особое внимание при окрашивании высушенных стекол ввиду возможности возникновения артефактов).
7. Если монослой подлежит окрашиванию немедленно, фиксирующий раствор смывают дважды стерильной водой; промывные воды отбрасывают.
8. Добавляют рабочий раствор бисбензимида R или другой подходящий агент, обладающий способностью вызывать появление окраски при взаимодействии с ДНК, и выдерживают в течение 10 минут.
9. Краситель удаляют и промывают монослой водой.
